SuperScript IV VILO預(yù)混液（SSIV VILO）包含了SuperScript IV RT，其配方經(jīng)專門優(yōu)化，能夠?yàn)檫M(jìn)行RT-qPCR應(yīng)用的研究者同時(shí)提供便利性和高效酶的性能優(yōu)勢(shì)。作為一款性能卓越的逆轉(zhuǎn)錄酶，SuperScript IV 逆轉(zhuǎn)錄酶的持續(xù)合成能力相比市面上其他類型的RT酶實(shí)現(xiàn)了顯著提升，從而能提供對(duì)低豐度靶標(biāo)更高的靈敏性，對(duì)RT反應(yīng)抑制劑更高的耐受性以及更快的反應(yīng)時(shí)間。本預(yù)混液的配方中還包含了專利的輔助蛋白，能夠在優(yōu)化的緩沖環(huán)境中進(jìn)一步提升RT酶與RNA模板之間的反應(yīng)效果，因此SSIV VILO擁有比SuperScript VILO或其他cDNA合成試劑盒更高的效率。??

在使用較低量的RNA起始樣本進(jìn)行14條靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的RT-qPCR分析時(shí)，SSIV VILO實(shí)現(xiàn)了高于其他參加測(cè)試的市售cDNA合成試劑盒的最高反應(yīng)效率（圖1）。在10分鐘的反應(yīng)條件下，SSIV VILO的C_t?值穩(wěn)定低2個(gè)循環(huán)以上。

圖1.SSIV VILO與其他10款市售第一鏈cDNA合成預(yù)混液之間的RT-qPCR反應(yīng)效率比較。根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說明，使用預(yù)混液和1 ng起始總HeLa RNA，在20 μL RT反應(yīng)中合成cDNA。。對(duì)于qPCR應(yīng)用而言，用戶需在10 μL InvitrogenTM EXPRESS qPCR超混液（貨號(hào)11785200）的反應(yīng)體系中使用1 μL的RT，與Applied BiosystemsTM TaqManTM 引物和/或探針（靶向特定的基因靶標(biāo)）進(jìn)行反應(yīng)。所顯示的qPCR結(jié)果相對(duì)SSIV VILO組的倍數(shù)改變進(jìn)行了歸一化計(jì)算 [=1/(2^(Ct SSIV VILO – Ct 比較組))]。

近年來的調(diào)查和定性反饋結(jié)果表明，研究人員對(duì)當(dāng)前的cDNA合成結(jié)果并不滿意，同時(shí)他們也不得不檢測(cè)越來越多的困難樣本，如含有抑制劑的純化不佳RNA，或已降解的RNA。為了解困難樣本反轉(zhuǎn)錄的效能問題，我們?cè)诙喾N抑制劑存在的條件下，將SSIV VILO與其他市售的cDNA合成試劑盒進(jìn)行了RT效率的比較。按照以下公式，以SSIV VILO反應(yīng)的C_t?值對(duì)其他供應(yīng)商的試劑盒所生成的C_t?值進(jìn)行歸一化計(jì)算：歸一化的Y值?= [1/2^(C_{t SSIV VILO}?-C_{t 供應(yīng)商?x})]。如圖3A所示，無論是否存在抑制劑，SSIV VILO在所有cDNA合成試劑盒中都表現(xiàn)出最高的反應(yīng)效率。與此類似，SSIV VILO還在冷凍樣本（圖3B）和FFPE樣本（圖3C）的cDNA合成反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)了更高的效能。

圖3A.SSIV VILO與其他8款市售預(yù)混液之間的比較。使用100 ng Hela總RNA，在20 μL RT反應(yīng)體系（加入或不加指定濃度的抑制劑）中進(jìn)行RT反應(yīng)。在10 μL qPCR反應(yīng)體系中，使用EXPRESS qPCR SuperMix和B2M基因靶點(diǎn)的TaqMan引物/探針評(píng)估qPCR的反應(yīng)效能。

圖3B.在20 μL RT反應(yīng)體系中，使用50 ng冷凍組織的RNA樣本進(jìn)行RT反應(yīng)，并對(duì)SSIV VILO與其他5款市售的預(yù)混液產(chǎn)品的反應(yīng)效果進(jìn)行比較。在10 μL qPCR反應(yīng)體系中，使用EXPRESS qPCR SuperMix和基因靶向TaqMan引物/探針評(píng)估qPCR的反應(yīng)性能。

圖3C.在20 μL RT反應(yīng)體系中使用50 ng FFPE的RNA樣本進(jìn)行RT反應(yīng)，并對(duì)SSIV VILO與其他4款市售的預(yù)混液產(chǎn)品進(jìn)行比較。使用EXPRESS qPCR SuperMix，以10 μL反應(yīng)體系和基因靶點(diǎn)針對(duì)性的TaqMan引物/探針評(píng)估qPCR的反應(yīng)性能。

無論您在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中使用何種化學(xué)檢測(cè)手段，SSIV VILO都能幫您獲得最靈敏的qPCR反應(yīng)效能。使用基于SYBR^TM?Green染料的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)法，SSIV VILO的靈敏度在其他市售試劑盒的平均4倍以上（圖4A）。類似的靈敏度也可在基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)中獲得（圖4b）。這里展示了SSIV VILO及其他兩家供應(yīng)商產(chǎn)品的?ΔC_ts_?值（C_t 供應(yīng)商），這些數(shù)值均使用SS VILO組的結(jié)果值進(jìn)行歸一化計(jì)算。在96個(gè)靶標(biāo)中的92個(gè)（96%）上，SSIV VILO都獲得了比同類產(chǎn)品更低的Ct值；在96個(gè)靶標(biāo)中的81個(gè)（84%）上，SSIV VILO都獲得了比SS VILO更低的C_t?值。這里的數(shù)據(jù)圖顯示了，在許多靶點(diǎn)上，SSIV?VILO都要比包括SS?VILO在內(nèi)的其他供應(yīng)商所提供的產(chǎn)品低2個(gè)C_ts。

圖4A.使用100 ng總Hela RNA樣本和20 μL的RT反應(yīng)體系，在SYBR RT-qPCR基因panel分析中比較SSIV VILO和其他3種市售的預(yù)混液（包括SS VILO）。在10 μL qPCR反應(yīng)體系中， 使用EXPRESS qPCR SuperMix和基因靶點(diǎn)針對(duì)性的SYBR引物/探針評(píng)估qPCR的反應(yīng)性能。